Préparation et traitement de groupes d’écouvillons pour la détection du gène de la matrice de l’influenza A et/ou de l’orthoavulavirus aviaire de type 1 par RT-PCR en temps réel
Ce protocole est une copie de la procédure opératoire standard (POS) utilisée par le laboratoire de référence international OIE/FAO pour l’IA de l’Animal and Plant Health Agency (Agence de la santé animale et végétale, APHA). Pour toutes questions techniques, veuillez contacter AIWRL@apha.gov.uk
Laboratoire de référence international OIE/FAO pour l’IA
1. Objet / Domaine d’application de ce protocole
1.1.1 Détecter rapidement l’ARN du virus de l’influenza aviaire A ou de l’orthoavulavirus aviaire de type 1 (AOAV-1) extrait de groupes d’écouvillons composés au maximum de cinq écouvillonnages cloacaux ou de cinq écouvillonnages bucco-pharyngés. Cette approche testant des groupes d’écouvillons a pour objectif de fournir une mise en garde précoce alertant de la présence du virus de l’influenza aviaire A ou de l’AOAV-1 dans un échantillon. Les protocoles décrits sont applicables pour les tests réglementaires visant les maladies aviaires à déclaration obligatoire (MADO), notamment dans le commerce international, dans les cas où une MADO est suspectée (les « cas signalés »), dans les tests de surveillance suivant la détection d’une MADO chez des volailles ou des oiseaux sauvages, et dans des tests visant à exclure une MADO. L’approche testant des groupes d’écouvillons est également applicable pour la détection spécifique des sous-types H5 et H7 des virus de l’influenza aviaire A.
1.1.2 Le protocole couvre le regroupement initial et le traitement des écouvillons. L’extraction des acides nucléiques et l’amplification consécutive par PCR du matériel composé d’acides nucléiques élués à partir d’écouvillons groupés, en utilisant des protocoles pour la détection générique du virus de la grippe A, des sous-types H5 et H7 du virus de l’influenza aviaire A ou de l’AOAV-1, sont décrites dans les protocoles indiqués dans la section 3.1.2.
Informations générales
1.2.1 Les protocoles décrits dans cette POS sont applicables pour les tests réglementaires visant les maladies aviaires à déclaration obligatoire (MADO), notamment dans le commerce international, dans les cas où une MADO est suspectée (les « cas signalés »), dans les tests de surveillance suivant la détection d’une MADO chez des volailles ou des oiseaux sauvages, et dans des tests visant à exclure une MADO. L’approche testant des groupes d’écouvillons est également applicable pour la détection spécifique des sous-types H5 et H7 des virus de l’influenza aviaire A.
2. Sécurité
2.1 Il relève de la responsabilité de votre laboratoire de vous assurer que toutes les procédures décrites dans ce protocole sont réalisées conformément aux normes de haute sécurité.
2.2 Compte tenu de la nature des échantillons soumis pour la détection du virus de l’influenza aviaire A ou de l’avulavirus aviaire de type 1 (AAvV-1), tous les matériels doivent être traités comme potentiellement infectés par le virus de l’influenza, l’AAvV-1 ou d’autres pathogènes pouvant affecter l’homme. Toutes les manipulations précédant l’inactivation du matériel dans le tampon de lyse AVL et l’éthanol à 100 % doivent être réalisées dans un poste de sécurité microbiologique (PSM). L’ajout à la fois de l’AVL et de l’éthanol est nécessaire pour inactiver le virus. Cette mesure est par conséquent nécessaire avant que les échantillons puissent être retirés en toute sécurité du PSM.
2.3 L’AVL est un agent chaotropique et dissoudra les protéines. Par conséquent, des gants doivent être portés en permanence, et des précautions doivent être prises pour que ce matériel n’entre pas en contact avec la peau ou les yeux. Dans cette éventualité, rincez la zone
affectée IMMÉDIATEMENT à l’eau du robinet, et contactez l’équipe médicale sur site si des brûlures surviennent.
3. Matériels
3.1 Documentation et logiciel
3.1.2 Références des documents de procédures:
Extraction de l’ARN d’échantillons biologiques.
Extraction des acides nucléiques à partir d’écouvillons avec le système Qiagen BioRobot Universal.
Influenza – Détection du gène de la matrice de l’influenza A par RT-PCR en temps réel avec sonde TaqMan®.
Dépistage par PCR en temps réel du virus de la maladie de Newcastle (VMN).
RT-PCR en une étape pour la détection des virus H5 & H7 de l’influenza aviaire et le séquençage du site de clivage.
Séquençage réglementaire de la maladie de Newcastle.
PCR en temps réel du virus de l’influenza aviaire H5 eurasien
PCR en temps réel du virus H7 eurasien pour la détection et le pathotypage d’isolats du virus de l’influenza aviaire H7 eurasien
3.2 Produits chimiques et réactifs
3.2.1 Bouillon d’infusion cœur-cervelle (Brain-Heart Infusion Broth, BHIB) contenant des antibiotiques (1 000 UI de pénicilline G ; 10µg/ml d’amphotéricine B ; 1 mg/ml de gentamicine).
3.2.2 Si du BHIB n’est pas disponible – du PBS avec antibiotiques peut être utilisé à la place.
3.2.3 Éthanol à 100 % (renouveler une fois par mois).
3.2.4 Tampon de lyse AVL.
3.3 Équipement
Poste de sécurité microbiologique (PSM). Tubes de microcentrifugation (1,5 ml).
Microcentrifugeuse (avec rotor pour tubes de 2 ml). Ciseaux à bouts ronds à usage unique ou pince à os.
Congélateur atteignant une température de -18°C ou inférieure pour la conservation des produits chimiques et réactifs.
Congélateur atteignant une température de -70°C ou inférieure pour la conservation des acides nucléiques extraits.
Mélangeur à vortex.
Pipettes étalonnées : veuillez vous référer au document GE 183 – Pipettes – utilisation, entretien et maintenance.
Embouts de pipettes stériles exempts d’ARNase avec filtre anti-aérosols.
Gants jetables, sans latex. Conteneur pour objets tranchants.
4. Procédure: méthode
4.1 Fiabilité du testé
4.1.1 Ce protocole est une procédure d’assistance et non un test.
Les essais de PCR consécutifs comprennent un contrôle positif pour chaque extraction. Les valeurs Ct obtenues avec le contrôle d’extraction et les normes (s’ils sont utilisés) doivent être comprises dans l’intervalle déterminé dans la POS correspondante. Dans le cas contraire, la raison de l’obtention d’un résultat aberrant doit être explorée.
Les valeurs de Ct obtenues avec le contrôle d’extraction positif et les valeurs d’efficacité des normes en pourcentage doivent être comparées sur la durée afin d’identifier les tendances susceptibles d’indiquer des performances insuffisantes de l’un des composants du test. Lorsqu’une tendance se dessine, sa cause doit être explorée.
4.2 Préparation et regroupement des écouvillons
4.2.1 Les écouvillons provenant du même site anatomique (zone bucco-pharyngée ou cloacale) sont regroupés pour être testés en groupes comprenant au maximum cinq écouvillons, p. ex. 20 écouvillons = 4 groupes de 5 écouvillons.
Par exemple, si 20 écouvillons bucco-pharyngés et 20 écouvillons cloacaux sont soumis en provenance d’un groupe épidémiologique pour une PCR en temps réel du gène M, huit tests PCR seront effectués pour ce groupe (et/ou huit tests PCR pour une PCR du gène L en fonction du ou des tests nécessaires).
Une paire de ciseaux ou une pince à os différente doit être utilisée pour les écouvillons cloacaux ou bucco-pharyngés de chaque groupe épidémiologique. Par conséquent, pour une soumission de 20/20, deux paires de ciseaux ou deux pinces à os doivent être utilisées.
4.2.2 Dans un PSM fonctionnant en classe I, regroupez au maximum cinq écouvillons provenant du même site anatomique dans un tube Eppendorf contenant un volume total de 1 ml de BHIB ou de PBS avec antibiotiques, selon la description ci-dessus.
4.2.3 Introduisez l’extrémité en coton de l’écouvillon dans le tube étiqueté de manière appropriée contenant le BHIB ou le PBS avec antibiotiques.
4.2.4 Utilisez une paire de ciseaux à bouts ronds à usage unique ou une pince à os pour couper la tige de l’écouvillon à proximité de l’extrémité en coton. Éliminez la partie restante de l’écouvillon non utilisable dans un récipient pour objets tranchants. Répétez cette procédure pour les écouvillons restants faisant partie du groupe.
4.2.5 Fermez le couvercle du tube.
4.2.6 Mélangez en agitant doucement le tube pendant un minimum de cinq secondes afin d’éluer le matériel provenant des écouvillons.
4.2.7 Laissez le tube reposer à température ambiante pendant une durée minimale de deux minutes pour que le matériel sédimente.
4.2.8 Répétez la procédure (4.3.3 à 4.3.8) pour les autres groupes d’écouvillons.
4.2.9 En fonction du nombre de groupes pour lesquels une extraction d’ARN doit être effectuée, choisissez soit un bloc S contenant 420 µl de tampon AVL par puits (extraction automatisée), soit des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml contenant 560 µl de tampon AVL (extraction manuelle).
Remarque : L’extraction manuelle de l’ARN pour chaque échantillon doit être envisagée en première intention. Si le nombre d’échantillons groupés est de 16 ou moins (effectuer une extraction manuelle). Si le nombre d’échantillons groupés est supérieur à 16 (effectuer une extraction automatisée).
4.2.10 Mélangez avec la pipette, en aspirant et en distribuant deux fois, avant de retirer 140 µl de solution d’éluant des écouvillons groupés et ajoutez directement le tampon AVL.
Mélangez à nouveau doucement cette solution avec la pipette (en aspirant et en distribuant deux fois). Éliminez l’embout de la pipette.
Remarque : Il peut être nécessaire d’« essorer » la solution de chaque écouvillon individuel en pressant l’écouvillon contre l’intérieur du tube afin d’obtenir 140 µl de solution pour les ajouter au tampon AVL.
4.2.11 Mettez en incubation à température ambiante pendant 10 minutes.
4.2.12 Dans chaque tube contenant l’éluant de l’écouvillon et le tampon AVL, distribuez 420µl d’éthanol à 100 % pour les (extractions automatisées) ou 560µl d’éthanol à 100 % pour les (extractions manuelles).
4.2.13 À ce stade, la réaction peut être retirée du poste de sécurité microbiologique conformément aux procédures de décontamination locales.
4.2.14 Les tubes contenant les cinq extrémités d’écouvillons groupés peuvent alors être conservés à -70°C dans l’éventualité où l’un d’entre eux devrait servir à une autre analyse. Les tubes testés négatifs doivent être conservés à -70°C pendant une durée minimum de trois mois, puis éliminés.
4.2.15 L’éluant des écouvillons groupés peut maintenant être utilisé pour une extraction d’ARN manuelle ou automatisée, décrite dans la (Section 4.4).
4.3 Extraction de l’ARN
4.3.1 Comme il a été indiqué dans la section 4.2.1, lorsque 16 échantillons groupés ou moins doivent être testés, effectuez une extraction manuelle de l’ARN en utilisant les réactifs de la minitrousse d’ARN viral QIAamp (Qiagen), conformément au protocole – « RNA extraction from biological samples » (Extraction de l’ARN d’échantillons biologiques).
Si le nombre d’échantillons groupés est supérieur à 16, effectuez une extraction automatisée de l’ARN conformément au protocole –
« Extraction of nucleic acids from swabs using the Qiagen Biorobot Universal » (Extraction des acides nucléiques à partir d’écouvillons avec le système Qiagen Biorobot Universal).
L’ARN extrait des éluats des échantillons groupés positifs doit être conservé à -70°C, tandis que les extraits provenant des éluats négatifs doivent être conservés à -70°C pendant une durée minimale de trois mois avant d’être éliminés.
4.4 Tests de RT-PCR en temps réel
4.4.1 Réalisez les tests de RT-PCR en temps réel sur chaque extrait d’acide nucléique conformément aux exigences des clients concernant le test, en suivant la procédure appropriée.